细胞实验 | 肿瘤细胞侵袭实验的开展

肿瘤细胞侵袭能力检测在肿瘤学（迁移、侵袭）和免疫学（迁移、趋化）中是常规实验。侵袭是细胞迁移的一种。细胞迁移分三种类型：趋触、趋化和侵袭。肿瘤细胞的侵袭性是肿瘤相关信号通路、药物治疗、靶向治疗、致癌/抑癌基因等肿瘤学研究的一个重要指标。

为了对肿瘤侵袭和转移有更加清晰的理解，我们先来了解一下，肿瘤细胞转移的过程，主要包括以下5个过程：原位侵袭，肿瘤细胞内渗，循环系统存活，肿瘤细胞外渗，形成转移灶等。其中细胞侵袭便发生在第一步，即肿瘤细胞在原位突破基底膜，然后内渗进入血管、淋巴管的过程，后期才开始进行转移。

实验原理

简单来说，将Transwell小室放入培养板中，并将高营养液与低营养液用一层膜隔开，并在膜上室铺基质胶，用来模拟体内细胞外基质。肿瘤细胞放在低营养液中，为了获得更多的营养吃的更饱，这些细胞需先分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，才能穿过这层膜，进入高营养液，最后通过计数下室的细胞量即可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

实验方法

1、复苏代数靠前的肿瘤细胞，在含有10% FBS的培养基中预先培养2-3代，待细胞汇合达到80%左右，饥饿处理18-24小时。

2、准备铺胶：

a）4 °C溶matirgel胶过夜

b）将细胞小室、培养板和枪头等于4°C 预冷

c）用无血清的冷培养基稀释matirgel胶至一定浓度，加入到细胞小室的上层（按照产品说明书的推荐比例和体积），轻轻摇晃使胶均匀铺在膜上。以上操作在冰上进行

d）立即将铺好matrigel胶的细胞小室置于培养板中，于37°C孵育1小时左右，matirgel胶可由液体凝成固体，吸走多余的或者未凝的胶

3、细胞用PBS清洗一次，胰酶消化，然后用包含5% BSA的无血清培养基中和，1500rpm离心5-10min。

4、用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度

5、取上述细胞液加入小室，下室（培养板）加入含有10% FBS的培养基。不同规格的小室和培养板所加的体积不同，具体参考产品说明书

6、37 °C孵育24至72小时，依据肿瘤细胞类型而定

7、孵育结束，小心取出细胞小室，吸掉小室上层培养液，PBS清洗一遍，70%酒精或者4%多聚甲醛固定5min，0.5%结晶紫（2%乙醇或PBS溶解）染色20min，然后进行第8步或者第9步。

8、PBS清洗两次以去除多余的染料，立即用棉签擦去滤膜上层的细胞，自然静置风干。显微镜下观察滤膜下层的细胞，随机选取不同的视野计数并算平均值。

9、结晶紫溶解滤膜下层细胞，然后用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm读取OD值。这种方法可以避免视野下细胞穿透不均匀带来的误差。

10、计数：Transwell侵袭实验结果统计分析有两种方法

直接计数法：通过给细胞染色，直接在镜下计数。选择不同的视野拍照（一般选择呈现视野中穿过的细胞），计数的结果可做成统计图，辅助呈现数据。

间接计数法：主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。它包括：MTT法、 荧光试剂检测、 结晶紫检测。

注意事项

1、肿瘤细胞最好经过饥饿处理，并且小室上下培养基的FBS有浓度差，以保证细胞可以穿透基质胶。

2、铺细胞要均匀，滤膜底部不能产生气泡，否则会导致细胞染色不均匀，或者局部细胞无法穿透。

3、侵袭实验的细胞密度比较大，不同肿瘤细胞的接种密度、培养时间不同，需要实验摸索。细胞太少，迁移不过去；细胞太多，可能导致正常组和实验组无差异。

4、首次做实验需要用正常的细胞摸索合适的细胞密度和培养时间，确定之后再加实验组，同时如果条件允许，设置一组已知高迁移性的细胞作阳性对照。

5、注意细胞小室内外培养基的比例，不要使小室外培养基超过小室内培养基液面。

6、观察细胞时一定要擦去小室内部贴在膜上的细胞。