EU新生RNA检测试剂

EU新生RNA检测试剂

产品简介
    细胞内新生RNA的变化是评价细胞活性的重要指标。EU (5-Ethynyl-Uridine) 是一种尿嘧啶核苷类似物, 能够在细胞RNA转录时期代替尿嘧啶(U) 掺入新合成的RNA分子中, 然后通过基于EU 与荧光染料的特异性共轭反应，把荧光集团标记到新合成的含有EU 的RNA分子中，这样就可以进行较快的的荧光检测RNA的转录活性。本试剂盒将直接测定细胞内新生RNA的变化。
    传统的检测新生RNA的方法为以放射性同位素标记RNA等方法然后进行Southern blot进行检测。但是这种方法需要放射性同位素标记及后续的复杂操作步骤。利用EU标记新生RNA的检测方法不需要剧烈的RNA变性，只需温和的细胞固定化和透化处理，能够较好地保护细胞形态、RNA整体结构及细胞内抗原识别位点，操作步骤更加便捷、灵敏和准确，能在细胞水**映新生RNA转录活性的状况。该试剂只需要简单的操作步骤，适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜以及高内涵筛选仪进行新生RNA的转录活性。
试剂组分

运输及保存方式
       蓝冰运输。-20℃避光长期保存，避免反复冻融。如短时间内需多次重复使用，请于4℃避光保存，有效期半年。
使用前须知
该试剂是采用成像检测方法对贴壁细胞进行检测，适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜等仪器。非贴壁细胞可在孵育EU后进行细胞涂片处理，固定后再采用贴壁细胞的染色流程进行检测。
实验准备
1、盖玻片
2、1×PBS（pH7.2-7.6）（用DEPC水配置）
3、含0.5% Triton X-100的PBS（用DEPC水配置）
4、甘氨酸溶液(2mg/ml) （用DEPC水配置）
5、培养板或培养皿
实验参考

 
实验步骤(以96孔板，HK2贴壁细胞为例)
细胞培养
       取对数生长期细胞，以每孔4×103~1×105细胞接种于96孔板中，培养至正常状态。
EU标记
      1、将细胞完全培养基中按照500：1的比例加入EU溶液，制成2×EU标记培养基；
      2、提前将2×EU标记培养基预热，然后等体积加入到细胞原有培养基中，获得1×EU溶液，其中EU的终浓度为500 μM；
       注：1）我们不建议替换全部培养基，因为这样可能会影响细胞增殖的速度；
              2）配置好的培养基建议现用现配，用量以没过细胞为宜；
      3、每孔加入300 μl含EU培养基孵育细胞2小时，弃培养基；
       注：1）培养时间取决于细胞的增殖速度和生长状态；
              2）孵育时间至少2小时，可延长至24小时后再检测也可以。
      4、以1×PBS清洗细胞两次，每次5分钟，以除去未掺入RNA的EU残留。
       注：贴壁不牢的细胞可降低清洗强度。
细胞的固定和通透
      1、每孔加入150 μl 细胞固定液，室温培养30分钟，弃固定液；
     注：1) 该试剂盒配备了细胞固定液，也可以使用含4%多聚甲醛的PBS来进行细胞固定；
            2) 如果使用其他的细胞固定剂建议用DEPC水来配置，避免RNA酶降解细胞内的RNA。
      2、每孔加入150 μl 2mg/ml 甘氨酸，摇床孵育5分钟；
      3、弃甘氨酸溶液，每孔加入300 μl PBS洗液，室温清洗5分钟；
      4、每孔加入300 μl 0.5% Triton X-100细胞通透液，室温通透10分钟，弃细胞通透溶液；
      5、每孔加入300 μl PBS洗液，室温清洗5分钟；
EU染色
      1、通过用10：1去离子水稀释10×反应缓冲液进行配制1×EU 反应缓冲液；
      2、按照溶解200 mg缓冲添加剂溶于1 ml去离子水的比例称取适量的粉末进行溶解，即为可用的缓冲添加剂的浓度，建议现用现配；
     注：缓冲添加剂为白色粉末，较难准确称量，称量范围可稍微放宽，但是不应超过±20%，且该粉末较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需报废或更换。
按照以下的表格进行染色反应液的配制：

       3、每孔加入100 μl 配置好的检测混合液，以覆盖细胞为宜，避光、室温孵育30分钟；
       4、弃染色反应液，加入100 μl 0.5% Triton X-100细胞渗透液清洗2-3次，每次10分钟；
       5、弃细胞渗透液，用PBS洗两次，每次5分钟。
DNA染色
       1、将Hoechst 33342用RNase-free水溶液1：1000进行稀释得到终浓度为5 μg/ml的1×Hoechst染色液；
       2、每孔加入100 μl 1×Hoechst染色液，室温避光孵育20-30分钟后，弃染色液；
       3、每孔加入100 μl PBS洗细胞两次，去掉洗液。
图像获取及分析
建议染色完成后立即进行荧光显微镜拍照观察；如果条件限制，请于4°C条件下避光湿润保存3天之内完成拍照。若为细胞爬片或涂片，可使用抗荧光淬灭封片剂进行封片后于4°C条件下保存及拍照检测。