兔骨髓间充质干细胞
兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离培养
【简介】
骨髓间充质干细胞是骨髓基质干细胞，对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）来支持造血。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潜能，能促进间充质组织的再生，如：骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质等组织;
【材料】
超净台、PBS、废液桶、75%酒精、手术包、percoll分离液、培养基、培养瓶等；
【方法】
1）兔处死后, 放入75% 的酒精内浸泡15 min，无菌条件下取出双侧股骨、胫骨、肱骨，去除附带组织,浸入生理盐水中清洗2次；
2）镊子和剪刀分离出股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉，PBS溶液冲洗两遍，酒精棉布擦拭，清理干净外骨骼，移入6cm培养皿；
3）培养液浸泡，剪掉头尾，露出骨髓腔用无菌注射器抽取含10%FBS的L-DMEM针头刺穿冲洗骨髓腔；
4）用培养液进行反复吹打，制备骨髓单细胞悬液转入离心管，1000 r/min离心3min，弃上清、脂肪层，重复离心1次；
5）细胞沉淀加入4ml含10%FBS的L-DMEM重悬细胞，使用Percoll梯度分离；
注：Percoll调整为1.073浓度，4ml细胞悬液加入含5ml分离液的离心管；
6）2000RPM/20min，取中间浑浊单核细胞层，PBS两倍稀释后悬液1000RPM/3min，弃上清，10%FBS的L-DMEM重悬细胞，移入10cm Dish，37°、5%CO2培养；
7）24h后换液（视细胞贴壁情况），之后3天换一次液；
【培养】
干细胞专用培养液
【鉴定】
四、鉴定
1）流式细胞鉴定：
阳性：CD29、CD90、CD44、CD105、CD166;
阴性：CD34、CD45、CD80、CD86;
